Forschung/mukoviszidose/PD: Einfluss von Sildenafil Print

29. Jahrestagung der GPP, München, 22. - 24. März 2007
Abstract: Atemwegs- Lungenkrkh. 33: 89 (2007)

 

Einfluss von Sildenafil auf elektrophysiologische Parameter bei respiratorischen Epithelzellen von Mukoviszidose-Patienten

 

C. Rückes-Nilges, K. Haus, D. Schüler, H. Lindemann

CF-Zentrum, ZKJ, Uni-Klinikum Giessen u. Marburg, Feulgenstr. 12, D-35385 Giessen

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Einleitung:

 

Mukoviszidose ist die häufigste angeborene Stoffwechselerkrankung. Durch verschiedene Punktmutationen kommt es zur Expression eines defekten Cl- -Transportproteins in den Epithelzellen von Mukoviszidose-Patienten. So fehlt beispielsweise dem Protein, bei dem mit 70-80 % häufigsten Gendefekt (ΔF508), ein Phenylalanin in Position 508. Diese Mutation führt zu einer gestörten Reifung des als Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) bezeichneten Cl- -Kanals, woraufhin dieser von den Zellen „aussortiert“ wird und erst gar nicht die Zellmembran erreicht.

Frühere Studien haben gezeigt, dass verschiedene Phosphodiesterase (PDE)-Inhibitoren in der Lage sind, dieses „Aussortieren“ des ΔF508-CFTR zu verhindern, der Kanal die Zellmembran erreicht und dort noch eine Restleitfähigkeit aufweist [1, 2].

In der vorliegenden Studie sollte untersucht werden, ob der in klinischer Anwendung befindliche PDE-Inhibitor Sildenafil das Potential hat, den ΔF508-CFTR in die Zellmembran einzubauen und den bei Mukoviszidose gestörten Cl-  -Transport zu stimulieren.




Abb. 1 Der PDE-Inhibitor Sildenafil in seiner klinisch gebräuchlichen Form



Methodik:

 

Für die Messungen stand uns die Zelllinie CFBE 41o- zur Verfügung, die dem humanen Bronchialepithel entstammt und homozygot für ΔF508-CFTR ist. Sie bietet somit ein gutes Modell, um den bei CF defekten Ionentransport zu simulieren (eine Spende von Dr. Gruenert, Universität von Kalifornien). Die Zellen werden vor der Messung in der Ussing-Kammer für 14 bis 21 Tage auf Kollagen-Membranen (0,2 µm Anopore® Membrane, Nunc) kultiviert.

Die konfluenten Zellen werden in eine speziell konstruierte Ussing-Kammer eingespannt. Die auf  37 °C beheizbare Kammer setzt sich aus zwei Hälften zusammen, die nur durch das Gewebe von einander getrennt sind. Zur Messung werden Ag/AgCl-Elektroden benutzt, die über eine Agar/KCl-Brücke elektrisch mit der Messkammer verbunden sind. Die Ussing-Kammer wird an eine Wechselstromquelle angeschlossen, was es uns ermöglicht Kapazitätsmessungen durchzuführen und über die Änderung der Kapazität (Cm) Rückschlüsse auf die Größe der Oberfläche des Zellmonolayers zu ziehen. So kann verfolgt werden, ob neue Membranteile in die Zellmembran eingebaut werden. Mit Hilfe des Kurzschlussstromes (ISC) und des Leitwertes (Gt) kann eine Aussage über das Ionentransportverhalten der Epithelzellen getroffen werden. Während der gesamten Messung werden kontinuierlich der Kurzschlussstrom, der Leitwert und die Kapazität des Gewebes registriert.

 



Abb.2 Die bei der Studie verwendete Ussing-Kammer vor und während der Messung

 


Ergebnisse:


Unter basalen unstimulierten Bedingungen war bei CFBE 41o--Zellen keine elektrogene Cl- -Sekretion oder Na+ -Absorption nachweisbar. Nach Applikation von Sildenafil kam es zu einer konzentrationsabhängigen Stimulation des transepithelialen Kurzschlussstromes. Durch den Cl--Kanal-Blocker NPPB ließ sich dieser Prozess zumindest teilweise hemmen. Parallel hierzu war nach Sildenafil-Gabe ein Anstieg des Leitwertes und eine Erhöhung der Kapazität zu beobachten.

 


Abb. 3: Dargestellt ist die Originalspur einer Ussing-Kammer-Messung an CFBE 41o- -Zellen. Nach ca. 10 min Perfusion mit normaler Ringerlösung hatten die Zellen ein stabiles Ausgangsplateau erreicht und der epitheliale Na+ Transport wurde durch 100 µM Amilorid gehemmt. Anschließende Gabe von Sildenafil in steigender Konzentration von 100 – 400 µM führte zu einer deutlichen Erhöhung der Kapazität, was bedeutet, dass neue Membranteile in die Zellmembran des Zellmonolayers eingebaut wurden. Parallel hierzu war eine signifikante Steigerung der Leitfähigkeit und des Kurzschlussstromes zu beobachten, die partiell durch den Cl- -Kanal-Blocker NPPB hemmbar war. Die erhaltenen Ergebnisse sprechen dafür, dass es sich bei den neu eingebauten Membranteilen um den ΔF508-CFTR handelt, der noch eine beträchtliche Restleitfähigkeit aufweist.

 


Abb. 4 a und b : Zusammenfassende Darstellung von 12 Versuchen mit dem Versuchsablauf, wie er in Abb. 3 dargestellt ist.

 


Fazit:

 

Die Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass der Phosphodiesterase-Inhibitor Sildenafil in der Lage ist, das „Aussortieren“ von ΔF508-CFTR bei der Mukoviszidose-Zelllinie  CFBE 41 o- zu verhindern. Somit wird der fehlerhaft produzierte Cl- -Kanal in die Zellmembran eingebaut, wo er noch eine beträchtliche Restleitfähigkeit aufweist.

 

 

Literatur:

 

[1] Cobb, B.R., Fan, L., Kovacs, T.E., Sorscher, E.J., Clancy, J.P. Adenosine receptors and phosphodiesterase inhibitors stimulate Cl- secretion in Calu-3 cells. American  Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 29, 410-418, 2003.

[2] Dormer, R.L., Harris, C.M., Clark, Z., Pereira, M.M.C., Doull, I.J.M., Norez, C., Becq, F., McPherson, M.A. Sildenafil (Viagra) corrects ΔF508-CFTR location in nasal epithelial cells from patients with cystic fibrosis. Thorax 60, 55-59, 2005.